美國Integrated DNA Technologies公司（以下簡稱IDT）創(chuàng)辦于1987年，是寡核苷酸合成領(lǐng)域的翹楚，在過去的30多年里IDT致力于為學(xué)術(shù)研究、農(nóng)業(yè)發(fā)展、醫(yī)療診斷、藥物研發(fā)等領(lǐng)域開發(fā)和制造核酸產(chǎn)品，IDT可以為客戶提供高品質(zhì)的產(chǎn)品、專業(yè)的技術(shù)支持和個性化的定制服務(wù)。在分子生物學(xué)領(lǐng)域，IDT為二代測序、基因編輯、qPCR和RNA干擾等領(lǐng)域開發(fā)了一系列專有技術(shù)。IDT生產(chǎn)的GMP級別產(chǎn)品被廣泛應(yīng)用于多種癌癥以及遺傳和感染性疾病的診斷試劑研發(fā)，并通過不斷優(yōu)化自動化合成平臺的處理技術(shù)來加快原研試劑的開發(fā)和生產(chǎn)。
       IDT為100多個國家和地區(qū)的超過120,000名生命科學(xué)研究人員提供服務(wù)，每天生產(chǎn)70,000多條核酸產(chǎn)品。IDT針對基因組學(xué)應(yīng)用開發(fā)的創(chuàng)新工具和解決方案正在打破研究壁壘，激發(fā)您的夢想，實現(xiàn)下一個突破。

一、CRISPR/Cas9系統(tǒng)介紹

       CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一種來自細(xì)菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機制。在細(xì)菌及古細(xì)菌中，CRISPR系統(tǒng)共分成3類，其中Ⅰ類和Ⅲ類需要多種CRISPR相關(guān)蛋白（Cas蛋白）共同發(fā)揮作用，而Ⅱ類系統(tǒng)只需要一種Cas蛋白即可，這為其能夠廣泛應(yīng)用提供了便利條件。目前，來自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。

       Cas9蛋白（含有兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域，可以分別切割DNA兩條單鏈。Cas9首先與crRNA及tracrRNA結(jié)合成復(fù)合物，然后通過PAM序列結(jié)合并侵入DNA，形成RNA-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)，進而對目的DNA雙鏈進行切割，使DNA雙鏈斷裂。

      研究人員為了將CRISPR/Cas9技術(shù)發(fā)展為高效的基因打靶工具，又進行了優(yōu)化和改造。Cong, L.等人[1]在不影響系統(tǒng)效率的情況下，將crRNA和tracrRNA融合為一條RNA。通過這種簡化，CRISPR/Cas9系統(tǒng)現(xiàn)僅包括兩個元素：Cas9蛋白和sgRNA（single guide RNA）。因此現(xiàn)在人們將CRISPR/Cas9技術(shù)也稱為Cas9/sgRNA技術(shù)。

? 相關(guān)名詞解釋與作用

CRISPR：成簇間隔短回文序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)；
crRNA： (CRISPR RNA)用于識別基因組序列；
tracrRNA： (trans-acting crRNA)用于招募和激活Cas9；
Cas9蛋白：CRISPR-associated genes家族的一員，用于切割DNA，（CRISPR-associated genes家族，包括Cas1、Cas2、Cas4和效應(yīng)蛋白如Cas9、Cpfl等?？衫闷涔ぷ鳈C制切割特定DNA片段，從而進行基因編輯。
 該系統(tǒng)非常高效，因此crRNA只需要最少的設(shè)計工作。需要提供的是一個與您靶基因中的PAM（前間區(qū)序列鄰近基序；NGG）序列緊鄰的、具有位點特異性的19或20個堿基的序列。注：NGG 代表AGG,TGG,GGG,CGG四種可能，滿足其中一種即可。

        總結(jié)：crRNA+tracrRNA都是直接得到最佳！

4、輔助試劑

⑴ Purified carrier DNA，通過電穿孔提高Cas9核糖核蛋白(RNP)的遞送。專門設(shè)計來避免與人類、小鼠和大鼠基因組的同源性

⑵ 小分子化合物，可以提高同源定向修復(fù)的比率

⑶g of plasmid.

四、IDT基因編輯關(guān)聯(lián)產(chǎn)品
 

1.Ultramar® 合成

IDT 采用耦合技術(shù)，Ultramer® DNA 合成的耦合效率在行業(yè)中成為第一，具備生產(chǎn)長達200 bases 單鏈DNA 的能力。每條Ultramer® DNA 序列都會通過ESI-MS 進行質(zhì)檢。

圖. 耦合效率決定序列合成終產(chǎn)物全長序列的比例、如上圖所示，Ultramer® 優(yōu)勢在合成長序列時尤為明顯。合成200個堿基的序列時，在耦合效率為98.5%的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)下，正確合成全長產(chǎn)物比例僅為5%；而耦合效率為99.5%（Ultramer® 技術(shù)）時約高達38%。高耦合效率可以保證完整準(zhǔn)確的全長序列。

2. HDR Donor Oligos

lt-R™ HDR Donor Oligos旨在增加在基因組編輯實驗中homology-directed repair（簡稱HDR，是細(xì)
胞內(nèi)一種修復(fù)DNA雙鏈損傷的機制）的修復(fù)率。

這些定制的產(chǎn)品會利用專有的修飾來合成以增加donor oligo的穩(wěn)定性，從而提高基因組雙鏈斷裂后成功組合進基因組的機會。

• 最長200個堿基
• 經(jīng)過修飾的單鏈DNA donor oligo
• 3-5天即可發(fā)貨
• 兩種規(guī)格可選 2 nmol 或者 10 nmol（可根據(jù)客戶要求提供大包裝）

IDT同樣會在網(wǎng)站上發(fā)布新的HDR設(shè)計工具。工具能夠提供多種不同的輸入方式用于選擇需要編輯的靶標(biāo)基因組序列，工具包含一個直觀的界面，可在編輯區(qū)域內(nèi)進行所需的序列編輯。一旦研究者提供編輯內(nèi)容及編輯位點的詳細(xì)說明，這個工具將會提供推薦的CRISPR-Cas9 guide RNAs 和相應(yīng)的HDR donor oligos。在重新核查后，客戶可以輕松下單，并且能夠根據(jù)需求創(chuàng)建新的基因組變更項目。HDR設(shè)計工具同樣支持適用于更長基因組變更的Megamer單鏈DNA片段的訂購。
 

3. Custom Gene Synthesis

IDT提供高質(zhì)量的、序列經(jīng)驗證的人工基因定制合成服務(wù)。定制基因和MiniGene™合成基因使用gBlocks®Gene Fragments或Ultramer® DNA Oligos構(gòu)建，同時配以全面質(zhì)控以確?；蛐蛄械臏?zhǔn)確性。
質(zhì)量控制和序列驗證
定制基因和MiniGene™基因產(chǎn)品的全部插入片段均在兩條鏈上進行序列驗證。通過Sanger測序進行序列驗證；某些情況下，使用MiSeq®系統(tǒng)（Illumina）測序替代Sanger測序。一般情況下，質(zhì)控結(jié)果包括色譜圖、質(zhì)粒圖譜和FASTA文件。IDT的基因合成產(chǎn)物終都以質(zhì)粒形式交付，這個克隆載體可以直接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。 為了優(yōu)化生產(chǎn)和交付時間，長度≤5kb的合成基因均插入含有篩選標(biāo)記的載體，用戶可根據(jù)需要選擇Amp或Kan抗性。 接收到基因產(chǎn)物后，可以使用很多方法將基因序列亞克隆到其他載體中?？寺≥d體的序列和插入位點等信息在隨貨文件中可見。
可應(yīng)用于
· 蛋白表達
· miRNA 基因
· IVT模板
· 基因變異和SNP分析
 

基因編輯相關(guān)的周圍產(chǎn)品

• ·合成基因可選載體

可能影響合成、組裝或測序結(jié)果的情況如下

•二級結(jié)構(gòu)：>10個堿基的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和富含G / C的二級結(jié)構(gòu)
•重復(fù)序列和同聚序列：長重復(fù)序列，G / C>10個堿基，或A/T>30個堿基
•總體GC含量>65％，區(qū)域GC含量<25％
• 限制性位點重復(fù)和Dam / Dcm甲基化位點均可能干擾限制內(nèi)切酶酶切
 
 

4. gBlocks Gene Fragments

gBlocks基因片段是經(jīng)過序列驗證的，長度為125-3000 bp的雙鏈DNA分子片段，采用IDT的Ultramer®DNA Oligos合成技術(shù)。具有高準(zhǔn)確性、高性價比和應(yīng)用靈活等特性。
 
 

質(zhì)量控制和序列驗證

•通過毛細(xì)管電泳（ Capillary Electrophoresis ，CE）驗證片段長度。
•通過質(zhì)譜（Mass Spectrometry ）鑒定序列。
•在多數(shù)情況下，每個gBlocks基因片段重組克隆測序后， 80％*之上的克隆都包含期望的插入片段。

* 如果序列非常復(fù)雜，其保真度可能會降低?？梢酝ㄟ^適當(dāng)增加測序的克隆數(shù)目來獲得序列正確的插入片段         

可應(yīng)用于：         

           •基因構(gòu)建和修飾
           •CRISPR的基因&轉(zhuǎn)錄形成sgRNA
           •qPCR或PCR的標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)參
           •抗體研究，例如制備重組抗體
           •酶工程
           •疫苗研究

5、gBlocks Gene Fragment Libraries

IDT提供含有mixed base的251-500bp的基因片段庫，其優(yōu)勢在于：
•可以接受的成本生成多達數(shù)十萬的構(gòu)建變體。

•可以自由選擇克隆載體與克隆方法，包括Gibson Assembly®方法和平端或黏末端等克隆方案，實現(xiàn)輕松組裝

產(chǎn)品詳情

合成251-500bp中允許出現(xiàn)1-8個隨機堿基“N"的出現(xiàn)。注：N代表A,T,G,C任意一個堿基。
 

6、Megamer Single-Stranded DNA

IDT提供長度為201-2000個堿基的Megamer ssDNA片段，Megamer ssDNA經(jīng)克隆純化的DNA生成，因而純度特別高

         可應(yīng)用于：           

       · CRISPR介導(dǎo)的基因編輯的同源重組（HDR）            

      ·體外轉(zhuǎn)錄（IVT）等應(yīng)用中。

五、使用文獻

1.Vakulskas CA, Dever DP,   et al. (2018) A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells
Nat Med. 24:1216- 1224. doi: 10. 1038/s41591-018-0137-0.
2.Park SH, Lee CM, et al. (2018) Highly efficient editing of the beta-globin gene in patient derived
hematopoietic stem and progenitor cells to treat sickle cell disease. Blood, 132(Suppl 1),2192. doi: 10. 1182/blood-2018-99-l 17371.